血细胞分离机(干细胞采集)
一、原代细胞分离提取方法及注意事项
原代细胞是直接取自活组织
例如活组织检查材料
的细胞，并建立用于体外生长。这些细胞经历了非常少的群体倍增，因此与连续
肿瘤或人工永生化
细胞系相比，它们更能代表它们所衍生组织的主要功能成分，使得原代细胞成为更具代表性的体内模型。
原代细胞分离是指将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程，获得高纯度、高活性的原代细胞则是很多细胞实验成功的关键要素之一，原代细胞分离的方法有很多种：悬浮离心法、直接组织块法、酶消化法、非酶消化法、机械分散法等。
人或动物体内
或胚胎组织
由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用 1000r/min的低速离心 10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁 PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法
物理裂解
和消化分离法。
一
机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内
用九号针
，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤
常用注射器钝端
使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。
二
消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块
或糊状
，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
消化分离法的操作步骤
1
剪切把组织块剪碎，呈 1~5mm3大小的组织块。
2
加液漂洗将碎组织块在平皿
或三角烧瓶
中用无钙镁 PBS洗 2-3次
采用倾斜，自然沉降法
。
3
消化加入消化液
胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA
于 37℃水浴中作用适当时间
中间可轻摇 1~2次
，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。
4
弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。
5
漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗 2-3次后，加入完全培养基。
6
机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或 3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降 5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
注意事项如下
1
组织块必须漂洗 2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑制作用。
2
胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。
3
消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失
三、酶消化法
1）无菌
确保使用无菌设备、试剂和技术收集和处理组织。使用个人防护设备以避免污染。使用0.22微米的膜无菌过滤所有酶和试剂。
2）切块
用无菌剪刀或手术刀将组织标本切成小块
通常为2×4mm
，然后将小块放入选定的缓冲液、培养基或盐溶液中。
3）加酶
将组织清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入您选择的酶如胶原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，约0.5 mg/ml～1.5mg/ml的酶。
4）孵育
将组织样本在其最佳温度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分钟。定期混合或轻轻摇动标本。
5）洗涤
通过轻轻移液来分散细胞
也称为研磨
，然后，使用细网过滤细胞悬浮液。让细胞沉淀并滗出多余的含液酶;洗两到三次。含有FBS，BSA或其他抑制剂的洗涤溶液也可用于阻止酶消化。
6）分析
将细胞重悬于正确的培养基或缓冲液中，然后定量测定细胞产量和活力。这是细胞分离过程中的重要步骤，因此您可以评估解离技术的结果。大多数研究人员使用血细胞计数器测定细胞产量，并使用台盼蓝重氮染料测量细胞活力。
二、为什么医院里有离心机 是干什么用的
用于分离混悬在溶液中的颗粒
分离血液中的有形成分，浓缩体液中细胞或其他有形成分，作分析测定用
分离与蛋白结合或抗体结合的配体及游离配体等。
分离标本中已经沉淀的蛋白质。
分离两种不同密度互不相溶的液体
如用有机溶剂提取体液中某些成分。
分离血液中的脂质成分，如分离血浆中乳糜微颗粒及各种脂蛋白等。
8.医用离心机在医院里主要应用于血液成分的离心分层。医用离心机在医院一般用于血液分离，血细胞分离这些哦，进行血战等应用。
三、干细胞怎么提取
造血干细胞移植有两种方法,一是医生在供者的髂骨部位穿刺采集骨髓中的造血干细胞,术后一两天内有些疼痛,一周内就可完全恢复。此方法比较常见,但是捐献者会感到大腿有些疼痛的。
二是用科学的方法有效地动员骨髓和其他部位的造血干细胞大量释放到外周血液中去,从供者的手臂静脉中采集,并通过机器将造血干细胞分离出来,剩余的血液回输到供者体内。此方法就和正常献血一样,捐献干细胞既无碍健康,也没有危险,只需您付出一点勇气。目前大多数医院都是采用第二种方法,这种方法不使用麻醉,没有什么副作用,对供者很安全。
2、捐献造血干细胞的条件
凡年龄在18-45周岁,身体健康(符合无偿献血条件者),本人志愿均可捐献造血干细胞。捐献时只需到当地红十字会或血样采集点填写志愿捐献登记表,采集8-10毫升血样,就成为中华骨髓库一名造血干细胞捐献志愿捐献者。造血干细胞捐献无损健康,却能挽救一个白血病患者的生命,因为造血干细胞有高度的自我更新、自我复制能力,捐献造血干细胞后1-2周内,血液中各种成分即可恢复到原来的水平,对身体没有一点影响。
3、多少造血干细胞能救人
骨髓移植需要的是人体内的造血干细胞。一个成年人的骨髓重量约3公斤,一名供髓者提供10克的骨髓造血干细胞就能挽救一名白血病患者的生命。人体对造血干细胞具有很强的再生能力。正常情况下,人体各种细胞每天都在不断新陈代谢,进行着生成衰老,死亡的循环往复。失血或捐献造血干细胞后,可刺激骨髓加速造血,1—2周内,血液中的各种血细胞恢复到原来水平。因此,捐献造血干细胞不会影响健康。
造血干细胞的分类
1、造血干细胞移植有多种分类方法。造血干细胞来自于自身或他人,分别成为自体造血干细胞移植和异体(又称异基因)造血干细胞移植,其中异基因造血干细胞移植又按照供者与患者有无血缘关系分为:血缘关系供者造血干细胞移植和无血缘关系供者造血干细胞移植(即无关移植);按移植物种类分为外周血造血干细胞移植、骨髓移植和脐带血造血干细胞移植。
2、自体造血干细胞移植时造血干细胞来源于自身,所以不会发生移植物排斥和移植物抗宿主病,移植并发症少,且无供者来源限制,移植相关死亡率低,移植后生活质量好,但因为缺乏移植物抗肿瘤作用以及移植物中可能混有残留的肿瘤细胞,故复发率高。
3、异基因造血干细胞移植时造血干细胞来源于正常供者,无肿瘤细胞污染,且移植物有免疫抗肿瘤效应,故复发率低,长期无病生存率(也可以理解为治愈率)高,适应证广泛,甚至是某些疾患惟一的治愈方法,但供者来源受限,易发生移植物抗宿主病,移植并发症多,导致移植相关的死亡率高,患者需长期使用免疫抑制剂,长期生存者生活质量可能较差。
造血干细胞的作用
1、造血干细胞有两个重要特征,高度的自我更新或自我复制能力,可分化成所有类型的血细胞。造血干细胞采用不对称的分裂方式:由一个细胞分裂为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性,从而保持身体内干细胞数量相对稳定,这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞,释放到外周血中,执行各自任务,直至衰老死亡,这一过程是不停地进行着的。
2、造血干细胞是能自我更新、有较强分化发育和再生能力、可以产生各种类型血细胞的始祖细胞。造血干细胞来源于红骨髓,可以经血流迁移到外周血液循环中,不会因献血和捐献造血干细胞而损坏造血功能。
3、应用骨髓移植来治疗血液系统疾病,通过把捐献者的造血干细胞移植到受者体内,以重建受者的正常造血及免疫功能。
四、如何使用血细胞分离机在外周血中提取DC细胞
我又查了查分两种，一、收集骨髓：用细针从供体髂骨部位抽取骨髓，这些富含干细胞的骨髓将被贮存起来以备移植。采集过程中，供体处于麻醉状态下，不会感到痛苦。
二、采集外周血干细胞：外周血中也存在干细胞，但数量相对较少，需要用一些细胞因子如粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等药物来增加外周血中干细胞的数量。当干细胞数量足够多后，就可以通过血细胞分离术进行采集。血液通过血细胞分离机分离后，干细胞被分离出来，而其余血液回输给供体。采集到的干细胞也将贮存到移植时。一次分离需要3－4小时，为了采集到足够数量的干细胞，通常需要进行1－3次分离术。
前两年附近有人得了白血病用的就是第一种，但是要是捐给干细胞库，只是抽点血，用于化验的
