酚氧化酶和多酚氧化酶(抗坏血酸相关酶活性的测定)

一、抗坏血酸过氧化物酶什么颜色

淡黄色。抗坏血酸过氧化物酶在处于正常状态下的颜色是淡黄色的。抗坏血酸过氧化物酶是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶，又是维生素C代谢的主要酶类。

二、抗坏血酸相关酶活性的测定

实验四抗坏血酸含量及抗坏血酸过氧化物酶活性的测定

一、抗坏血酸含量测定

【原理】

还原型抗坏血酸(AsA)可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉(4，7－二苯基－1，10－菲咯啉，BP)反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸(DAsA)可由二硫苏糖醇(DTT)还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。

【仪器与用具】

离心机；分光光度计；研钵；试管。

【试剂】

5％三氯乙酸(TCA)；

20％TCA；

无水乙醇溶液；

0�4％磷酸—乙醇溶液；

0�5％BP—乙醇溶液；

0�03％FeCl3—乙醇溶液；

0�6g／L DTT；

NA2HPO4—NAOH溶液：以0�2Mol／L NA2HPO4和1�2Mol／L NAOH等量混合；

60MMol／L DTT—乙醇。

【方法】

1.制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14Mg／L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1�0Ml于试管中，加入1�0Ml 5％TCA、1.0ml乙醇摇匀,再依次加入0�5Ml 0�4%H3PO4—乙醇、1�0Ml 0�5％BP—乙醇、0�5Ml 0�03%FeCl3—乙醇，总体积5�0Ml。将溶液置于30℃下反应90Min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。

2.提取取植物叶片1�0g，按1∶5(W／V)加入5%TCA研磨，4000r／Min离心10Min，上清液供测定。

3.测定

(1)AsA测定取1.0Ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。

(2)DAsA测定向1.0Ml样品液中加入0�5Ml 60MMol／L DTT—乙醇溶液，用NA2HPO4—NAOH混合液，将溶液PH调至7～8,置于室温下10Min，使DAsA还原。然后加入0�5Ml 20％TCA，把PH调至1～2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA,即得DAsA含量。

二、抗坏血酸过氧化物酶(AsA－POD)活性

【原理】

AsA－POD催化AsA与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。随着AsA被氧化，溶液中290nM波长下的消光值(A290)下降，根据单位时间内A290减少值，计算AsA－POD活性。AsA氧化量按消光系数2�8(MMol／L)／CM计算，酶活性可用每克鲜重每小时氧化AsA的微摩尔数μMol／g·H表示。

【仪器】

离心机；紫外分光光度计；研钵；试管。

【试剂】

50MMol／L K2PO4—KH2PO4缓冲液(PH7�0，内含0�1MMol／L EDTA－NA2)�

0�3MMol／L AsA；

20μMol／L AsA；

0�06MMol／L H2O2。

【方法】

1�酶液制备取1�0g植物叶片剪碎，按1∶3(W／V)加入预冷的50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用两层纱布过滤，滤液在4000r／Min下离心10Min，上清液作酶粗提液供测定。

2.酶活性测定3Ml反应混合液中含50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液(PH7�0)，0.1MMol／L EDTA－NA2，0.3MMol／L AsA，0�06MMol／L H2O2和0.1Ml酶液。加入H2O2后立即在20℃下测定10～30s内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。

【思考题】

1.抗坏血酸在植物体内有何生理意义�

2.简述抗坏血酸过氧化物酶活性的测定原理。

三、过氧化物酶的测定中钼酸铵的作用

过氧化物酶的测定中钼酸铵的作用

钼酸铵是一种显色剂,能够定量测定过氧化物的质量,加在这里是要精确测定过氧化物含量。

钼酸铵（又特种钼酸铵；(T-4)-钼酸铵；四钼酸铵；钼酸二铵；）易于纯化、易于溶解、易于热解离，而且，热解离出的NH3气随加热可充分逸出，不再污染钼产品。因而，钼酸铵广泛用作生产高纯度钼制品的基本原料。比如，热解离钼酸铵生产高纯三氧化钼、用硫化氢硫化钼酸铵溶液生产高纯二硫化钼，通过钼酸铵生产各种含钼的化学试剂等。钼酸铵也常用作生产钼催化剂、钼颜料等钼的化工产品的基本原料。

过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的囊泡,直径约为0.5～1.0μm,通常比线粒体小。

普遍存在于真核生物的各类细胞中,但在肝细胞和肾细胞中数量特别多。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质,"氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中",从而对细胞起保护作用。

酶活性测定

按常规法提取健株与病株的粗酶液，

①用愈创木酚法测定过氧化物酶活性；

②用碘酸钾滴定法测定多酚氧化酶活性；

③用碘量法测定过氧化氢酶活性

:wanfangdata../qikan/periodical.articles/fjlxyxb/980121.htm

过氧化物酶活性测定采用愈创木酚法

:shac.gov./nkrx/kjdt/lwzj/t20040726_106488.htm

后者是指从辣根中提取的一种过氧化物酶

过氧化物酶都能把过氧化氢分解成氧气和水...

做法就是定时,定量的过氧化氢,在定量的酶的催化下产生了多少氧气.

SOD不是过氧化物酶，是超氧化物歧化酶。它是一种新型酶制剂,在生物界的分布极广,几乎从人到单细胞生物,从动物到植物,都有它的存在。它对于治疗因超氧离子(O_2~(u-))引起的各种疾病均有一定的疗效,尤其治疗类风溼关节炎、红斑痕疮,皮肌炎等均有明显效果。此外,在防辐射,防衰老,抗肿瘤等方面也已进入临床。广告里面的SOD蜜就是有它的成分。

过氧化物酶（辣根过氧化酶，181U/mg）溶液（约0℃）：取1.7mg过氧化物酶（Serva, Nr,31943）溶于5ml蒸馏水。

辣根，别名：马萝卜，拉丁学名：Armoracia rusticana.属罂粟目，十字花科、辣根属多年生直立草本。全体无毛。根肉质肥大，纺锤形，白色，下部分枝。茎粗壮，表面有纵沟，多分枝。原产欧洲东部和土耳其，已有2000多年的栽培历史。中国的青岛、上海郊区栽培较早，其他城郊或蔬菜加工基地有少量栽培。根有特殊辣味，含烯丙（基）硫氰酸（C3H5CNS），磨碎后干藏，备作煮牛肉及奶油食品的调料，或切片入罐头中调味。中国自古药用，有利尿、兴奋神经之功效。还具有较强的抗癌效果。

过氧化氢酶只是加快过氧化氢分解的，想到于催化剂。过氧化氢酶的作用是使过氧化氢还原成水： 2H2O2=O2↑+ 2H2O

而氧化酶（oxidase）过氧化物酶体中的主要酶类，氧化酶约占过氧化物酶体酶总量的一半。

各种氧化酶作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢：

RH2+ O2→ R+ H2O2

所以它们之间的区别就是一个是分解过氧化氢的，一个是产生过氧化氢的。

一般的酶很难下一个具体的定义，就找到这个，希望对你有帮助。

维生素C过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是植物体内的重要酶系,是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分,是清除H2O2(特别是叶绿体中的H_2O_2)的关键酶。

:emuch./journal/article.php?id=CJFDTotal-SWCX200806050

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium)5．776在初始发酵培养基中产胞外锰过氧化物酶活力极低。为了显著提高锰过氧化物酶活力，对初始发酵培养基进行优化。通过调整培养基中碳源、氮源种类和含量，吐温80新增量，Mn^2+终浓度，静置培养温度、时间，采用分光光度计法测定酶活力，发现黄孢原毛平革菌在限氮高锰培养基中产生较高的锰过氧化物酶。静置液体培养的优化条件是：葡萄糖10g／L；酒石酸铵2mmol／L；吐温80 lg／L；Mn^2+ 9．9μg／L；于34℃静置培养5d；产MnP活力达1200U／L，比优化前提高了近17倍。

四、抗坏血酸被氧化后产物是什么

维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含疏基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还不十分清楚。抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出 H+，而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。由于维生素在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物材料中维生素含量的测定是十分必须的。抗坏血酸的定量测定方法很多，有2,6—二氯酚靛酚（简称DCIP）滴定法、碘滴定法、2,4—二硝基苯肼法、 Folin试剂比色法、紫外吸收法等。其中广泛采用的是DCIP滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。在酸性环境中，抗坏血酸（还原型）能将染料2,6—DCIP还原成无色的还原型2,6—DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型2,6—DCIP在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2,6—DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2,6—DCIP立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2,6—DCIP便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时2,6—DCIP标准溶液的消耗量(mL)，可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型2,6—DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2,6—DCIP标准溶液滴定至终点。食物和生物材料中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2,6—DCIP还原脱色。为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗坏血酸后，再用2,6—DCIP滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时2,6—DCIP标准溶液的总消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2,6—DCIP标准溶液的消耗量，即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2,6—DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血酸的含量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原物质与2,6—DCIP反应速度的差别，并通过控制样品溶液在pH1— 3范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用，一般在这样的条件下，干扰物质与2,6—DCIP的反应是很慢的或受到抑制。生物体液（如血液、尿等）中的抗坏血酸的测定比较困难，因为这些样品中抗坏血酸的含量很低，并且存在许多还原物质的干扰，同时还必须预先进行脱蛋白处理。在生物体液中含有巯其、亚硫酸盐及硫代硫酸盐等物质，它们都能与DCIP反应，但反应速度比抗坏血酸慢得多。样品中巯基物质对定量测定的干扰，通常可以藉加入对—氯汞苯甲酸(简称PCMB)而得到消除。希望对你有所帮助